干貨分享丨代謝流分析介紹
01 什么是代謝流分析？
代謝流分析（Metabolic Flux Analysis, MFA）是利用穩(wěn)定同位素示蹤技術，檢測下游代謝產物的同位素取代形式（M+0/ M+1/ M+2/ …），從而分析出該化合物在代謝通路中的流向和分布。通過對生物體進行代謝流分析，可得到生物體特定代謝通路的活躍程度。
02 為什么要做代謝流分析？
通常代謝組學檢測的是生物樣本中的代謝物濃度，而代謝流反映的是細胞內代謝反應的速率。這其中就包括在酶參與下的中間產物的轉化、代謝物在各器官、組織間的轉運速度等。用交通車流來舉個例子：馬路上的車流量（通量）隨著車輛數(shù)量（濃度）的增加而增加，當發(fā)生交通擁堵時，車輛數(shù)量（濃度）是高峰，而車流量（通量）確近乎零。同樣，在代謝過程中，代謝物的積累（高濃度）可能是由于合成的增加，也可能是由于代謝的減少。要想知道這個代謝物的主要活性途徑、各個途徑的相對貢獻和分布變化特點，就需要用到代謝流分析。
因此，代謝流能揭示代謝調節(jié)的位點和機理，并且加深我們對代謝物如何參與細胞決策的理解。此外，在病變細胞中，代謝流信息也能幫助我們進行治療手段的選擇。
03 哪些情況需要做代謝流分析？
需要回答“從哪來？”和“到哪去？”的研究，都需要做代謝流分析。舉例 ：腫瘤細胞的碳源來源、特定靶點誘導或抑制后代謝通路的活躍或抑制程度。
與代謝流相關的幾個常見的關注問題是：1）發(fā)現(xiàn)特定營養(yǎng)物的分解代謝命運；2）發(fā)現(xiàn)一個給定的細胞內化合物的生物合成起源；3）對特定代謝節(jié)點或反應的通量進行有針對性的分析；4）測定細胞氧化還原平衡（例如：NADPH和NADH）和能量（ATP）載體。
04 代謝流分析如何做實驗設計？
代謝流一般有兩種基本的實驗設計方式，包括靜態(tài)實驗和非靜態(tài)實驗。
靜態(tài)實驗：在同位素標記平衡終點進行測量。優(yōu)點：同位素標記模式完全取決于代謝物水平。缺點：只能解決不同通路對同一衍生物的相對貢獻率，不能根據(jù)時間進行線性定量，需要持續(xù)足夠的時間以達到同位素穩(wěn)態(tài)。
非靜態(tài)實驗：在達到同位素標記平衡之前進行測量。優(yōu)點：標記實驗可以短至幾分鐘，可以根據(jù)時間進行線性定量。缺點：需要對多個時間點的同位素標記情況進行測量，樣本的檢測和分析過程更為復雜，并且，同位素標記水平取決于代謝流量和細胞內代謝物水平。
因此，我們首先要明確所關注代謝通路和相關代謝物，然后往培養(yǎng)基中添加13C標記的“來源物質”，根據(jù)相關代謝通路確定合適的培養(yǎng)時間，收獲樣本（細胞、培養(yǎng)基）后液氮速凍，轉移至-80度冰箱保存，送檢時使用干冰快遞寄出。
05 細胞培養(yǎng)時間是多長？
沒有一個固定值，對于靜態(tài)實驗來說，細胞培養(yǎng)時間（標記的持續(xù)時間）取決于感興趣的途徑多長時間達到一個代謝穩(wěn)態(tài)。通常在糖酵解途徑中是10分鐘，TCA循環(huán)約2小時，核苷酸則需要不少于24小時。
06 代謝流檢測用什么技術？
主要是用質譜技術，對于豐度較高的代謝物如葡萄糖也可以用NMR技術。質譜主要是利用不同取代形式的質量數(shù)有差別進行區(qū)分。
07 博萊克可以檢測哪些代謝流？
從理論上說，靶向定量檢測項目中包括的代謝物，我們都可以檢測代謝流。比如TCA、膽汁酸、氨基酸等。但是并不是所有目標物都有合適的方法進行檢測，具體情況需要咨詢我們。
08 代謝流結果會以什么形式交付？
大部分時候，我們交付的是相對定量結果，即該種同位素形式占總和的百分比。該目標物各種同位素形式的峰面積之和為1。
如果客戶有特殊要求，我們會根據(jù)檢測項目評估是否可以做絕對定量，交付濃度結果。但是對于豐度較低的同位素形式，可能存在定量結果不準確（低于定量限）甚至檢測不到的情況。
09 送檢需要的樣本類型和樣本量是多少？還需要哪些信息？
細胞和培養(yǎng)基上清均可以檢測代謝流，樣品量根據(jù)關注的代謝通路有所區(qū)別，詳情可以咨詢我們。
除了樣品類型、細胞個數(shù)以外，還需要告訴我們細胞培養(yǎng)時的使用的同位素（取代信息）和關注的目標物。
10 結果中M+2是什么意思？
我們用M來代表未被取代的目標物，M+1代表分子量比目標物+1（如果是13C標記物培養(yǎng)的，就代表有1個12C被13C取代了的形式），M+2以此類推。
以丙酮酸為例，實驗用13C全標的谷氨酰胺培養(yǎng)，就會存在M/M+1/M+2/M+3共4種同位素取代形式，因為丙酮酸本身只有3個碳原子。M+2又會有3種同分異構體形式，質譜無法區(qū)分這些同分異構體，給出的是這3種同分異構體之和。
