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新文速遞丨bioRxiv酪胺會促進結(jié)直腸癌
結(jié)直腸癌（CRC）是全球第三大常見癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大病因。家族性腺瘤性息肉病、飲食和腸道微生物群等因素是促進CRC的危險因素。此外，研究表明大量食用紅肉或加工肉類和脂肪，纖維攝入量低可能會增加CRC風(fēng)險。
酪胺在加工肉類中含量很高，在CRC患者的糞便和粘膜組織中也很豐富。目前僅知曉酪胺會提高血壓，少量研究表明酪胺與細胞毒性相關(guān)，會改變結(jié)腸上皮細胞中DNA損傷和修復(fù)相關(guān)基因的表達譜。然而，酪胺對腸粘膜健康和CRC的影響尚不明確。
2023年5月，帝國理工學(xué)院Jia Li教授團隊發(fā)表題為“Tyramine promotes colon cancer risk and development by inducing DNA damage and inflammation”的研究成果。該研究假設(shè)源自發(fā)酵食品的酪胺或腸道細菌對酪氨酸的代謝會增加CRC風(fēng)險并促進CRC發(fā)展。作者使用HCT116細胞系和ApcMin/+小鼠驗證這一假設(shè)。原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2023.130893。
實驗設(shè)計
細胞實驗：用不同濃度的酪胺水溶液（0.2 mM-6.4 mM，pH=7.01）將HCT116細胞（人結(jié)腸癌細胞）分別處理24、48、72h，每孔取一定量用于活率、基因毒性、流式細胞計數(shù)分析。用0-1000pg/mL的IL-6處理細胞24、48、72h用以評估炎性環(huán)境對酪胺治療的影響。并對其進行細胞凋亡、細胞周期、增殖和DNA損傷分析。
動物實驗：將6周齡的ApcMin/+和WT小鼠每天用200µL 3.2 mM、pH=7.01 的無菌酪胺溶液或水（對照）進行口服飼喂，持續(xù) 7 周，在小鼠13周齡時結(jié)束實驗。在整個研究過程中每周監(jiān)測小鼠的食物消耗量、水攝入量和體重。對小鼠疾病宏觀體征的發(fā)展進行盲評分，并在第4和7周收集小鼠的尿液和糞便，對收集的樣本進行RNA測序和1H NMR等分析。
研究結(jié)果
酪胺誘導(dǎo)的細胞死亡和DNA損傷
用0-6.4mM的酪胺處理HCT-116細胞24、48、72h，0.8 mM處理24h酪胺表現(xiàn)出細胞毒性，在濃度高于1.6mM時毒性作用可維持至72h（圖1A），低濃度的酪胺未表現(xiàn)出細胞毒性。在酪胺處理后壞死細胞發(fā)生的頻率以劑量依賴的方式增加；與對照組相比，高濃度酪胺處理后，壞死細胞數(shù)量隨著凋亡細胞數(shù)量的減少而增加，存在劑量依賴性的壞死（圖1B）。
已知細胞增殖和DNA不穩(wěn)定性增加是腫瘤發(fā)生的危險因素，因此，作者探究酪胺是否會影響細胞增值和誘導(dǎo)DNA損傷。與對照組相比，用1.2和1.6 mM的酪胺處理24h后，Ki67陽性細胞占比明顯升高（圖1C），磷酸化組蛋白 H2AX細胞形成γH2AX的頻率明顯更高（圖1D），表明細胞對DNA雙鏈斷裂的誘導(dǎo)有反應(yīng)。此外，作者使用MN試驗評估酪胺誘導(dǎo)的 DNA 損傷，用1.2和1.6 mM的酪胺處理誘導(dǎo)了MN（微核）的形成（圖1E和1F），表明DNA損傷和染色體畸變的增加。作者在酪胺治療后6h計數(shù)γH2AX 陽性細胞，酪胺未誘導(dǎo)顯著的基因毒性效應(yīng)。
圖1. 酪胺降低細胞存活率的主要原因是壞死，并增加微核和雙核細胞的數(shù)量
作者觀察到1.2和1.6 mM 的酪胺誘導(dǎo)細胞周期停滯在G2/M期（圖1G），雙核細胞的數(shù)量增多（圖1H）。酪胺處理后，發(fā)現(xiàn)G2期γH2AX陽性細胞的數(shù)量顯著增加，提示DNA修復(fù)機制的激活（圖1I）。培養(yǎng)基的代謝譜分析顯示，酪胺處理的細胞和未處理的細胞分別聚集，表明細胞周期停滯影響細胞新陳代謝和養(yǎng)分利用。此外，作者的研究數(shù)據(jù)顯示，IL-6不會加重酪胺誘導(dǎo)的細胞毒性和基因毒性。
總體而言，作者發(fā)現(xiàn)酪胺會導(dǎo)致細胞壞死，促進細胞增殖和DNA損傷，這可能會破壞基因組的穩(wěn)定性，增加結(jié)腸腫瘤發(fā)生的風(fēng)險。
酪胺影響DNA組織和氧化呼吸途徑
為了探究酪胺的作用機理，作者將對照組和酪胺處理組（1.2和1.6 mM處理24h）的細胞進行了RNA測序�；虮磉_譜的PCA圖表明這兩組細胞間存在顯著差異（圖2A），兩種劑量的酪胺誘導(dǎo)了類似的細胞反應(yīng)模式，但低劑量組的程度較低。與對照組相比，在1.6 mM和1.2 mM酪胺處理的細胞中，總共有524個和241個差異表達的基因（圖2B）。熱圖展示了對照組和酪胺處理組基因表達的差異，主要是組蛋白基因下調(diào)以及參與氧化/還原反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的基因上調(diào)（圖2C）。
對涉及生物過程的基因本體論（GO）的通路分析表明，1.6 mM酪胺處理組染色質(zhì)組織和組裝網(wǎng)絡(luò)顯著減少，對轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因表達的表觀遺傳控制產(chǎn)生影響（圖2D），這與該劑量下MN出現(xiàn)頻率增加的結(jié)果一致。涉及NADP/NAD的氧化和還原反應(yīng)顯著減少，表明影響到線粒體的功能（圖2E）。IPA 分析一致顯示，酪胺處理后出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)和DNA損傷修復(fù)增強，同時NAD信號通路下調(diào)（圖2F）。此外，與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移信號傳導(dǎo)和腫瘤微環(huán)境相關(guān)的過程也得到增強。為了進一步支持酪胺在氧化損傷中的作用，基因集富集分析 (GSEA) 顯示活性氧中基因集的過度表達（圖2G）。
RNA測序數(shù)據(jù)分析共同表明，酪胺影響DNA結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致氧化應(yīng)激，這可能是其基因毒性和細胞毒性作用的原因。
圖2. 酪胺改變涉及染色質(zhì)構(gòu)象、氧化還原反應(yīng)和CRC信號傳導(dǎo)的基因表達譜和通路
酪胺促進 ApcMin/+小鼠腫瘤的發(fā)生并增加 WT鼠CRC的風(fēng)險
基于以上研究結(jié)果，作者進一步在ApcMin/+小鼠體內(nèi)探究酪胺對CRC發(fā)展的影響（圖3A）。小鼠的體重、食物攝入、飲水在整個研究的各組間無顯著性差異（圖3B-D）。與野生型對照組相比，無論給藥方案如何，ApcMin/+小鼠脾臟重量顯著增加，血細胞比容顯著降低（圖3E-F）。然而，各組間的肝臟重量相當（圖3G）。酪胺給藥的小鼠，ApcMin/+小鼠的腸道比WT小鼠腸道更短（圖3H），表明酪胺和小鼠的遺傳菌株之間存在相互作用導(dǎo)致腸道長度的這種表型變化。組織學(xué)分析表明，CRC易感小鼠的不典型增生程度相似，與用藥無關(guān)，酪胺給藥不會導(dǎo)致組織學(xué)變化（圖3I）。
宏觀評估表明，接受酪胺給藥的ApcMin/+小鼠患腫瘤的數(shù)量往往更高，尤其是在結(jié)腸中（圖4A）。相較于WT型小鼠，ApcMin/+小鼠患腫瘤的數(shù)量和比例均更高，但在ApcMin/+小鼠中是否給藥酪胺，小鼠患腫瘤的數(shù)量沒有顯著差異（圖4B-E）。酪胺對結(jié)腸中腫瘤的大小有顯著影響，酪胺給藥的ApcMin/+小鼠結(jié)腸中1-3mm的腫瘤更多（圖4F）。
相比于ApcMin/+小鼠的對照組，給藥酪胺會有顯著影響，導(dǎo)致Ki67+細胞數(shù)量增加（圖4G），β-連環(huán)蛋白的水平在各組中相似（圖4H），這些數(shù)據(jù)表明給藥酪胺促進了細胞的增殖，但不影響Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路。在ApcMin/+小鼠中，是否給藥酪胺的兩組小鼠中γH2AX+細胞數(shù)沒有顯著性差異，但WT型小鼠中給藥酪胺γH2AX+的細胞數(shù)顯著高于對照組，說明酪胺可引起體內(nèi)DNA損傷（圖4I-J）。這些數(shù)據(jù)表明，酪胺促進腸道腫瘤APC模式腫瘤的發(fā)生，促進了WT小鼠DNA的損傷。
圖3. 酪胺給藥的 ApcMin/+和WT小鼠的表型特征
圖 4. 酪胺促進 ApcMin/+小鼠CRC發(fā)展并增加WT對照小鼠CRC風(fēng)險
酪胺影響ApcMin/+小鼠回腸和結(jié)腸中涉及炎癥和細胞外基質(zhì)的基因通路
小鼠口服酪胺后，并未在其尿液或糞樣中檢測出酪胺，表明均已被腸道吸收。為了更深入了解酪胺在體內(nèi)腫瘤發(fā)生中的功能，作者對ApcMin/+和WT的無腫瘤結(jié)腸和回腸組織進行了轉(zhuǎn)錄組分析。分析結(jié)果顯示，酪胺炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達水平上調(diào)。在酪胺給藥組中，結(jié)腸組織IL-17A基因表達上調(diào)，回腸組織中性粒細胞顆粒蛋白基因的表達水平上調(diào)（圖5A-B）。
GSEA通路分析顯示，給藥酪胺后，結(jié)腸組織中參與細胞外基質(zhì)組織的基因富集，線粒體活性基因表達降低。相反，回腸中細胞外基質(zhì)組織通路和膠原蛋白生物合成通路下調(diào)，表明腸道上皮屏障的變化（圖5C-D）。結(jié)腸和回腸中觀察到的差異歸因于它的生理差異及酪胺與腸道內(nèi)相關(guān)受體的結(jié)合差異。在給藥組，包括細胞外基質(zhì)糖蛋白和基底膜的通路均下調(diào)，表明腫瘤中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和骨髓對周圍基質(zhì)的侵襲。
圖5. 酪胺促進周圍健康腸道組織的炎癥環(huán)境，從而促進ApcMin/+小鼠中腫瘤的發(fā)生
酪胺影響WT小鼠回腸和結(jié)腸的細胞周期和上皮屏障功能通路
研究發(fā)現(xiàn)，與未處理的小鼠相比，酪胺給藥的WT小鼠結(jié)腸中細胞分裂周期基因（Cdc34b）的表達顯著上調(diào)，同時，結(jié)腸和回腸中與上皮屏障功能相關(guān)的基因包括防御素和C型凝集素（Defb14 和Clec2）的表達水平升高（圖6A-B）。
與只經(jīng)過酪胺給藥的 ApcMin/+小鼠相似，與細胞外基質(zhì)成分相關(guān)通路的基因在酪胺給藥的WT小鼠結(jié)腸中過度表達，然而，從G1期到S期的細胞周期控制減弱，表明細胞增殖控制減少；蛋白質(zhì)翻譯與合成途徑的基因在酪胺給藥組回腸中的表達上調(diào)，表明細胞分裂增加（圖6C-D）。與未給藥的對照組相比，這些觀察結(jié)果與酪胺給藥的WT小鼠和酪胺處理的HCT116細胞中更高水平的Ki67+細胞一致�？偟膩碚f，研究數(shù)據(jù)表明，酪胺驅(qū)動健康腸道組織中的炎癥環(huán)境，正如ApcMin/+小鼠中IL-17A和Ngp基因的上調(diào)所證明的那樣，并且在Apc缺陷和野生型環(huán)境中與細胞增殖增加和上皮屏障受損有關(guān)。
圖6. 酪胺改變野生型小鼠上皮屏障功能相關(guān)基因的表達譜
酪胺促進腫瘤微環(huán)境中的致瘤免疫反應(yīng)
酪胺已被證明可以增加巨噬細胞中炎癥基因的表達，因此，作者使用流式細胞術(shù)進一步研究回腸和結(jié)腸腫瘤中免疫細胞亞群的功能。作者在結(jié)腸腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）中的淋巴、先天淋巴和骨髓細胞中觀察到相似的頻率，但NK細胞和多形核骨髓源性抑制細胞（PMN-MDSC）除外（圖7A）。與水處理的 ApcMin/+小鼠相比，酪胺給藥的NK細胞頻率較低，這伴隨著腫瘤微環(huán)境NK細胞中NKG2D的平均熒光強度（MFI）的降低（圖7B），表明酪胺可能會在腫瘤發(fā)生的早期階段損害有效的抗腫瘤反應(yīng)。此外，抑制標記物PD-1的MFI在CD8+ T細胞中顯示出較高的頻率，但未達到統(tǒng)計學(xué)顯著性（圖7C），表明既往細胞毒性CD8+ T細胞活化和潛在耗竭。研究結(jié)果表明，酪胺抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進腫瘤發(fā)展。
圖7. 酪胺抑制結(jié)腸腫瘤的抗腫瘤免疫反應(yīng)
全文總結(jié)
作者的研究報道了酪胺對HCT116細胞具有細胞毒性和基因毒性，并誘導(dǎo)細胞周期停滯和細胞壞死。參與染色體組織和氧化應(yīng)激的基因表達水平在酪胺處理的HCT116細胞中上調(diào)。作者在ApcMin/+小鼠的體內(nèi)實驗表明，酪胺顯著加劇了腫瘤發(fā)生，誘導(dǎo)了促炎反應(yīng)并增加了細胞增殖（圖7D）。最重要的是，在用酪胺給藥的小部分WT小鼠中，酪胺誘導(dǎo)了更高水平的DNA損傷，伴隨著細胞增殖和腫瘤發(fā)生增加的趨勢。
延伸閱讀：結(jié)直腸癌與動物模型
結(jié)直腸癌
根據(jù)WHO統(tǒng)計結(jié)果，癌癥是全世界的一個主要死因，2020年近1000萬例（或近六分之一）死亡由癌癥導(dǎo)致。最常見的癌癥是乳腺癌（226萬例）、肺癌（221萬例）、結(jié)腸和直腸癌（193萬例）以及前列腺癌（141萬例）。
ApcMin/+小鼠
APC（adenomatosis polyposis coli）基因編碼的蛋白是一種腫瘤抑制蛋白，充當Wnt信號傳導(dǎo)途徑的拮抗劑。APC-β-catenin-TCF主導(dǎo)的Wnt通路失調(diào)是家族腺瘤息肉病發(fā)生的主要途徑。APC蛋白表達的缺失或降低可能導(dǎo)致β-catenin免于降解，使游離的β-catenin在胞漿內(nèi)集聚并進入核內(nèi)，激活相關(guān)靶癌基因，導(dǎo)致細胞癌變的發(fā)生。APC蛋白還涉及其他生物調(diào)節(jié)過程，包括細胞遷移和粘附，轉(zhuǎn)錄激活和細胞凋亡。
APC-Min（Min: multiple intestinal neoplasia）突變小鼠特指APC基因第850位氨基酸出現(xiàn)突變的C57BL/6J小鼠。APC基因第850位氨基酸從Leu突變成終止密碼子，導(dǎo)致翻譯提前終止。APC-Min小鼠品系采用基因編輯技術(shù)制作，該品系純合子不能存活。高脂飲食條件下，雄性和雌性雜合小鼠有明顯的腸道腺瘤且數(shù)量較多，多見于回腸和空腸。因此，APC-Min小鼠模型是理想的腸道腫瘤模型。
APCMin/+小鼠發(fā)病機制是突變的基因產(chǎn)物,截短APC蛋白導(dǎo)致腸道上皮細胞胞質(zhì)β-catenin蛋白的積累而后使其入核與TCF4/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動下游基因CyclinD 1等原癌基因的活化，但是其腺瘤發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和其他生物學(xué)特性尚未探索清楚。APCMin/+小鼠與人類家族性腺瘤性息肉�。‵AP）表現(xiàn)相似，目前是用于FAP藥物開發(fā)的理想模型。
