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新文速遞丨CellRepMed孕酮與前列腺癌
前言
前列腺癌的發(fā)展依賴于雄激素，雄激素剝奪療法（ADT）和阿比特龍聯(lián)合使用可降低患者雄激素水平。然而前列腺癌細(xì)胞可能利用其他腫瘤代謝物來促進(jìn)增殖。
越來越多的證據(jù)表明前列腺癌中存在其他腫瘤代謝物，類固醇與雄激素具有共同的環(huán)戊菲蒽四環(huán)結(jié)構(gòu)，可能有致癌作用，依賴或獨(dú)立于雄激素受體（AR）。然而，雄激素的強(qiáng)大功能掩蓋這些作用，接受ADT和阿比特龍聯(lián)合治療的患者可以提供一個(gè)獨(dú)特的模式來發(fā)現(xiàn)新的腫瘤代謝物。
2022年3月，復(fù)旦大學(xué)唐惠儒教授、同濟(jì)大學(xué)吳登龍教授及中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所李振斐研究員課題組共同在《Cell Reports Medicine》期刊發(fā)表了題為“Inhibiting 3βHSD1 to eliminate the oncogenic effects of progesterone in prostate cancer”的研究成果。在這項(xiàng)研究中，作者對(duì)接受ADT和阿比特龍治療患者的血漿樣本進(jìn)行了基于UHPLC-MS的代謝物篩選。作者發(fā)現(xiàn)孕酮在前列腺癌中作為一種致癌激素，激活典型和非典型雄激素受體（AR）靶基因，通過GATA2轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)細(xì)胞增殖。3β-羥基甾體脫氫酶1（3βHSD1）的抑制劑BCA可以抑制孕酮的生成，消除其致癌作用。血漿孕酮水平與臨床治療結(jié)果相關(guān)，孕酮有可能作為阿比特龍治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。下面由深耕代謝組學(xué)的青年學(xué)者劉平輝，為我們帶來這篇文章的全方位解讀。原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2022.100561。
研究結(jié)果
篩選潛在腫瘤代謝物
為確定導(dǎo)致疾病進(jìn)展新的腫瘤代謝物，收集了10名患者在阿比特龍治療前后的血漿樣本，并通過UHPLC-MS進(jìn)行分析。在6625個(gè)代謝物中，孕酮增加最多，雄烯二酮（AD）下降最顯著（圖1A）。上海同濟(jì)醫(yī)院73例患者的臨床數(shù)據(jù)也表明，在阿比特龍治療后孕酮增加最顯著（Figures 1B, 1C）。為了排除ADT的潛在干擾，僅在去勢(shì)抵抗性前列腺癌（CRPC）患者中進(jìn)一步分析血漿孕酮水平與治療反應(yīng)之間的相關(guān)性。終點(diǎn)血漿孕酮濃度較高的CRPC患者表現(xiàn)出較弱的前列腺特異性抗原（PSA）減少和較早的疾病進(jìn)展（圖1D, 1E）。研究表明孕酮在前列腺癌中是一種潛在的致癌激素。
孕酮調(diào)節(jié)的典型AR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
為了探討孕酮的致癌作用，用不同的前列腺癌細(xì)胞株分別用孕酮處理后進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。孕酮促進(jìn)AR陽(yáng)性細(xì)胞系（LNCaP和VCaP）生長(zhǎng)，但不促進(jìn)AR陰性細(xì)胞系（PC3和DU145）生長(zhǎng)，VCaP細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析證實(shí)孕酮處理后AR信號(hào)被激活（圖1F, 1G）。孕酮誘導(dǎo)的LNCaP和VCaP細(xì)胞的增殖依賴于雄激素受體（AR），而不是孕酮受體（PR）。由于LAPC4細(xì)胞中AR的含量有限，孕酮對(duì)LAPC4細(xì)胞的增殖沒有影響，孕酮僅在加入多西環(huán)素（Dox）時(shí)激活LAPC4細(xì)胞AR信號(hào)表達(dá)（圖1F-1I）。證明孕酮通過AR發(fā)揮其致癌作用。
競(jìng)爭(zhēng)分析表明孕酮對(duì)ART878A和ARH875Y有高親和力，但對(duì)ARW742L和ARM750T親和力低（圖1J）。孕酮可顯著激活ART878A和ARH875Y同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖，但不能激活ARW742L和ARM750T，在ARW742L的細(xì)胞中沒有觀察到細(xì)胞增殖（圖1K, 1L）。研究表明ART878A或ARH875Y患者可能對(duì)孕酮的致癌作用更敏感。
圖1 孕酮通過AR具有短暫致癌作用
孕酮調(diào)控的非典型AR靶基因
VCaP細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析顯示孕酮和雙氫睪酮（DHT）對(duì)幾條通路有不同的調(diào)節(jié)作用，孕酮治療后表明前列腺癌侵襲性的基因標(biāo)記都有所增加，但DHT治療后沒有增加（圖2A, 2B）。孕酮上調(diào)最重要通路通路被DHT抑制，AR參與其中（圖2C, 2D）。這些孕酮激活但DHT抑制的基因視為非經(jīng)典AR靶基因，非典型AR靶基因表達(dá)活躍的患者治療持續(xù)時(shí)間較短；孕酮對(duì)非經(jīng)典AR靶基因有調(diào)控作用, 敲除這些基因抑制了VCaP細(xì)胞的增殖（圖2E-2G）。以上研究表明孕酮通過對(duì)典型靶基因和非典型靶基因的調(diào)控，通過AR促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展。
圖2 受孕酮調(diào)控的非經(jīng)典AR靶基因
孕酮在生理水平上的致癌作用
分別用5 nM孕酮或乙醇處理LAPC4細(xì)胞生成Prog細(xì)胞和Ctrl細(xì)胞，Prog細(xì)胞表現(xiàn)出比Ctrl細(xì)胞更強(qiáng)的增殖能力（圖3A）。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，Prog細(xì)胞中雌激素反應(yīng)通路被激活，而雄激素受體（AR）、雌激素受體1 （ESR1）和孕酮受體（PR）的表達(dá)沒有改變（圖3B, 3C）。使用不同的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些參與雌激素反應(yīng)途徑的基因進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些基因在前列腺癌中頻繁擴(kuò)增，并隨著疾病的進(jìn)展表達(dá)增加，這些基因的高表達(dá)與較差的臨床結(jié)果相關(guān)（圖3D）。Prog細(xì)胞的qPCR進(jìn)一步證實(shí)了參與雌激素反應(yīng)途徑的基因活躍表達(dá)，敲除這些基因抑制了細(xì)胞的增殖（圖3E, 3F）�？偠灾硭降脑型谇傲邢侔┲芯哂欣鄯e的致癌效應(yīng)。
作者通過多種方式篩選到了具有潛在致癌效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子GATA2 （Figure3G）。GATA2的高表達(dá)不僅與癌癥治療失敗正相關(guān)，與參與雌激素反應(yīng)途徑的基因正相關(guān)，在Prog細(xì)胞中mRNA和蛋白表達(dá)水平的GATA2也增加；而敲除GATA2基因會(huì)影響雌激素反應(yīng)途徑基因的表達(dá)（Figure3H, 3I, 3M）。GATA2的抑制劑K7174抑制了Prog細(xì)胞中雌激素反應(yīng)途徑相關(guān)基因的表達(dá)； K7174在Prog細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用比在Ctrl細(xì)胞中更顯著，也會(huì)抑制Prog細(xì)胞的快速增殖（圖3J-3L）。敲除GATA2基因?qū)虮磉_(dá)和細(xì)胞增殖的影響在Prog細(xì)胞中更為明顯（圖3N, 3O）。轉(zhuǎn)錄組分析還顯示，針對(duì)GATA2的siRNAs抑制了Prog細(xì)胞的雌激素反應(yīng)途徑（圖3P）。從Prog細(xì)胞產(chǎn)生的異種移植比從Ctrl細(xì)胞產(chǎn)生的異種移植生長(zhǎng)更快，K7174特異性抑制Prog_細(xì)胞誘導(dǎo)的異種移植瘤生長(zhǎng)（圖3Q）。以上研究表明，GATA2介導(dǎo)了孕酮累積的致癌效應(yīng)，是前列腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。
圖3 孕酮通過GATA2累積的致癌效應(yīng)
靶向孕酮代謝阻斷孕酮的致癌作用
既往研究表明膽固醇產(chǎn)生的孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為孕酮，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為5α孕酮（5αP）、5β孕酮（5βP）以及相關(guān)的下游代謝物，利用3H孕烯醇酮在前列腺活檢樣本中證實(shí)了這一代謝途徑（圖4A, 4B）。研究服用阿比特龍患者血漿孕酮相關(guān)代謝產(chǎn)物的分布發(fā)現(xiàn)，孕烯醇酮、孕酮、5αP是患者體內(nèi)的主要代謝物，大多數(shù)代謝物激活LNCaP和VCaP細(xì)胞AR靶基因的表達(dá)；孕酮和5αP結(jié)合到AR的配體結(jié)合域，其對(duì)AR的親和力最強(qiáng)，孕烯醇酮對(duì)野生型AR和ART878A突變體的結(jié)合親和力有限（圖4C, 4D）。因此，孕烯醇酮的致癌作用可能源于其轉(zhuǎn)化為孕酮，這一假設(shè)在小鼠組織中得到驗(yàn)證，孕烯醇酮并不像孕酮那樣促進(jìn)前列腺類器官的形成，不能激活小鼠前列腺器官中的AR信號(hào)（圖4E-4H）。這些數(shù)據(jù)表明，抑制孕烯醇酮向孕酮的轉(zhuǎn)化是前列腺癌治療的潛在策略。
腎上腺不是孕烯醇酮和孕酮的唯一來源，前列腺周脂肪組織也可能通過旁分泌機(jī)制為前列腺癌細(xì)胞提供類固醇。前列腺癌根治術(shù)患者脂肪組織分泌物激活AR靶基因證實(shí)了該觀點(diǎn)，在激活AR脂肪細(xì)胞組織的分泌物中檢測(cè)到明顯更高濃度的孕烯醇酮 （圖4I, 4J）。由此可見，孕烯醇酮的療效并不局限于阿比特龍治療的患者。
圖4 孕酮相關(guān)代謝產(chǎn)物在前列腺癌中的作用
結(jié)合孕酮代謝途徑分析，類固醇生成酶3βHSD1是一個(gè)潛在靶點(diǎn)，可抑制孕烯醇酮向孕酮的轉(zhuǎn)化。結(jié)合既往研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂寧（Corylin）呈劑量依賴性地抑制DHEA向AD的轉(zhuǎn)化，Corylin的衍生物Bichanin A（BCA）是最有效的3βHSD1抑制劑（圖5A-5C）。通過細(xì)胞熱位移分析確定BCA和3βHSD1之間的潛在相互作用，BCA增加了3βHSD1的熱穩(wěn)定性，BCA探針證實(shí)了其抑制3βHSD1活性的功能（圖5D-5F）。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）-3βHSD1與BCA探針結(jié)合，加入DHEA或BCA會(huì)阻止這種結(jié)合作用，BCA與DHEA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合底物識(shí)別口袋3βHSD1（圖5G, 5H）。對(duì)參與BCA結(jié)合的3βHSD1的必需氨基酸進(jìn)行突變驗(yàn)證酶活，E126在識(shí)別BCA發(fā)揮了重要作用，E126A突變體完全損害了BCA的功能（圖5I）。BCA特異性抑制DHEA，但不抑制DHT誘導(dǎo)的AR靶基因表達(dá)（圖5J）。研究表明BCA可有效抑制3βHSD1的活性，抑制孕酮生成。
用孕烯醇酮和BCA共同作用于穩(wěn)定表達(dá)Dox誘導(dǎo)3βHSD1的VCaP細(xì)胞系，3βHSD1過表達(dá)可促進(jìn)孕烯醇酮向孕酮的轉(zhuǎn)化，而BCA可抑制孕烯醇酮向孕酮的轉(zhuǎn)化（圖5K）。BCA成功抑制了孕烯醇酮誘導(dǎo)的VCaP和LNCaP細(xì)胞的基因表達(dá)和細(xì)胞增殖，但對(duì)孕酮沒有影響，BCA抑制了孕烯醇酮但不是黃體酮-持續(xù)的異種移植發(fā)展（圖5L-5O）。總之，抑制孕酮的合成是阻斷孕酮致癌作用的可行策略。
圖5 BCA作為3βHSD1的抑制劑可消除孕酮的致癌作用
孕酮作為阿比特龍療效的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物
臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在阿比特龍治療3個(gè)月后，17名CRPC患者的血漿孕酮水平升高；觀測(cè)終點(diǎn)血漿孕酮水平較高的患者，在阿比特龍治療3個(gè)月后血漿孕酮水平也較高（圖6A, 6B）。阿比特龍治療3個(gè)月后血藥濃度>3 nM的患者，阿比特龍治療持續(xù)時(shí)間較短（圖6C）。臨床上常用阿比特龍治療3個(gè)月后PSA下降來評(píng)價(jià)療效，有11名患者的PSA較基線水平下降了50%以上，PSA下降較明顯的患者在阿比特龍治療3個(gè)月后血漿孕酮濃度較低（圖6D, 6E）。簡(jiǎn)而言之，服用阿比特龍的患者血漿孕酮水平早期升高，血漿孕酮水平作為阿比特龍治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物對(duì)預(yù)后有預(yù)測(cè)作用。
圖6 孕酮作為阿比特龍治療應(yīng)答的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物
總結(jié)
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雄激素以外的代謝物可能會(huì)推動(dòng)前列腺癌的進(jìn)展，作者利用UHPLC-MS技術(shù)對(duì)患者血漿代謝物進(jìn)行篩選并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)回顧分析，發(fā)現(xiàn)孕酮是前列腺癌的致癌激素。
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明確孕酮通過對(duì)典型靶基因和非典型靶基因的調(diào)控，通過AR促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展。
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轉(zhuǎn)錄因子GATA2介導(dǎo)了孕酮累積的致癌效應(yīng)，是前列腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。
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抑制孕烯醇酮向孕酮的轉(zhuǎn)化是前列腺癌治療的潛在策略， Bichanin A（BCA）可有效抑制類固醇生成酶3βHSD1的活性，抑制孕酮生成阻斷孕酮致癌作用。
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血漿孕酮水平升高與阿比特龍治療患者的不良臨床結(jié)果相關(guān)，血漿孕酮水平可作為阿比特龍治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。
