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經(jīng)典重讀丨Anal Chem脂蛋白亞類檢測新方法
脂蛋白根據(jù)密度大小可分為：乳糜微粒（CM）、極低密度脂蛋白（VLDL）、中密度脂蛋白（IDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）。進一步超速離心，每一種脂蛋白還能分為不同亞類，但是各種亞類相關(guān)的功能性研究寥寥無己，這些亞類的定量檢測長久以來一直缺乏合適的方法。
2018年10月，英國帝國理工學院的Jeremy K. Nicholson團隊在Analytical Chemistry上發(fā)表了方法學文章“Quantitative Lipoprotein Subclass and Low Molecular Weight Metabolite Analysis in Human Serum and Plasma by 1 H NMR Spectroscopy in a Multilaboratory Trial”，提出了一種基于NMR的脂蛋白亞類檢測方法，可快速定量分析臨床血樣中105種脂蛋白亞類和24種小分子代謝物，并進行了方法學驗證。迄今為止，該方法在多種疾病模型（包括COVID-19）中得到了應(yīng)用，已被96篇文獻進行了引用（截止日期：2022.06.14，數(shù)據(jù)來源google學術(shù)）。
引言
脂蛋白（Lipoprotein）是在血液中運送水不溶性脂類的超分子組裝體（球狀微粒），由富含膽固醇酯、甘油三酯的疏水性內(nèi)核和由載脂蛋白、單層磷脂、膽固醇等組成的外殼構(gòu)成。載脂蛋白是構(gòu)成脂蛋白的蛋白質(zhì)組分，主要分A、B、C、D、E五類�；竟δ苁沁\載脂類物質(zhì)及穩(wěn)定脂蛋白的結(jié)構(gòu)，某些載脂蛋白還有激活脂蛋白代謝酶、識別受體等功能。主要在肝（部分在小腸）合成，按ABC系統(tǒng)命名，每類又可細分幾個亞類，以羅馬數(shù)字表示。
其中VLDL可分為5個亞類（VLDL 1-5），LDL可分為6個亞類（LDL 1-6），HDL可分為4個亞類（HDL 1-4）。臨床上經(jīng)常使用的血脂檢測包括7項：總膽固醇（Cholesterols）、甘油三酯（Triglycerides）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、脂蛋白（a）、載脂蛋白A1（ApoA1）和載脂蛋白B（ApoB），檢測原理基于酶促反應(yīng)，僅需2分鐘。但是這樣得到的結(jié)果并不精準，總膽固醇和HDL是檢測得到的，剩下的指標如甘油三酯等都是通過計算得到的。此外，總膽固醇是不同種類脂蛋白上膽固醇的總量，也不區(qū)分游離膽固醇和固醇酯，其它指標也存在類似問題。
定量檢測脂蛋白的標準方法是使用超速離心機按照密度差異進行物理分離，然而這種方法非常耗時（每個樣品要經(jīng)過兩步離心程序約24小時），也僅僅只能獲得4或5種主要的脂蛋白（CM，VLDL，LDL，HDL2和HDL3）。每一種脂蛋白的組成各不相同，要想了解其功能，需要對各種亞類進行深入分析。
定量檢測脂蛋白的另一種快速方法是使用1H NMR技術(shù)。由于脂蛋白這類大分子末端的-CH3和-CH2-會在NMR圖譜中形成一系列疊加的寬峰，它們互相之間細微的化學位移差別是由于脂質(zhì)和顆粒本身大小產(chǎn)生的。而這兩類信號峰可以通過線性擬合的方式區(qū)分來自VLDL、LDL、HDL和蛋白質(zhì)的貢獻。經(jīng)過不斷的技術(shù)發(fā)展，我們基于1H NMR的信號去卷積結(jié)合多變量統(tǒng)計構(gòu)建了模型，可以對臨床血樣中105種脂蛋白亞類和24種小分子代謝物進行定量檢測，方法在多中心進行了驗證，重復性和準確性極高。
實驗過程
來自3個機構(gòu)的5個實驗室參與了本次研究，5個機構(gòu)分布在四個不同的地理位置，參與實驗的共有11臺設(shè)備，均為Bruker 600 MHz核磁共振波譜儀，均使用IVDr方法對樣品進行檢測。
標準物質(zhì)來自NIST的1951c（冷凍人血清中的脂類標準物質(zhì)）。
中心QC樣本來自37名健康志愿者（男19人，女18個），所有血樣先混合再等分20份/每中心，凍融次數(shù)一致，用于10天檢測期內(nèi)的質(zhì)量控制。
脂蛋白亞類檢測方法建立
使用Bruker商業(yè)化的IVDr方法（B.I.-LISA），先將基于PULCON方法的核磁譜圖歸一化為質(zhì)子濃度為mmol/L，再對數(shù)據(jù)進行均值中心化，化學位移較正使用TSP的甲基信號和丙氨酸雙峰的1.48 ppm信號。對化學位移為0.8 ppm（-CH3）和1.25 ppm（-CH2）的信號分別使用PLS-2回歸模型（使用兩個百人隊列建立）進行擬合，得到105種脂蛋白亞類濃度。
代謝物小分子檢測方法建立
使用內(nèi)部開發(fā)的基于圖形的Matlab算法實現(xiàn)，一維1H譜圖即可定量。
實驗結(jié)果
脂蛋白亞類方法精密度
1951c的甘油三酯、總膽固醇、LDL膽固醇、HDL膽固醇的濃度已知，將IVDr方法檢測得到的結(jié)果與之比較，兩者的相關(guān)度均高于0.90。檢測相對誤差低于13%，符合NECP的要求。
室內(nèi)室間重現(xiàn)性
方法具有極佳的重現(xiàn)性和精密度，均符合NECP的要求。
總結(jié)
臨床血清或血漿的脂蛋白亞類定量分析對于了解許多疾�。ㄖT如心血管疾病、代謝綜合征、神經(jīng)病理學和其它以脂質(zhì)謝紊亂為特征的疾�。┑陌l(fā)病機制是必要而重要的。我們評估了一種同時檢測血樣中105種脂蛋白亞類、12種比值和24種小分子代謝物的方法，結(jié)果可在11臺核磁共振波譜儀上得到重現(xiàn)，總誤差范圍在3.4%~10.5%之間（NCEP可接受的范圍是8.9%~15%），準確度極高，方法重現(xiàn)性也滿足相應(yīng)要求。這些數(shù)據(jù)表明，只要按照標準操作程序進行檢測，不同實驗室的結(jié)果的可靠性均能得到保證。
